北京地区猫弓形体感染情况调查

       近几年来，社会公共卫生安全已成为大家所关注的焦点问题。从2003年的“非典”，到猪链球菌，再到禽流感的流行，许多动物疾病，尤其是人畜共患病成为危害人类健康的潜在“杀手”。因此，对人畜共患病的流行状况的调查势在必行，从而对北京市犬类弓形体病的流行状况取得进一步的了解，为研究犬弓形体病的预防与控制方案，以及确定北京市消灭犬类重大疫情计划积累资料。

       随着我国国民经济发展和社会进步，犬与人类的关系日益密切。犬类饲养业正以强劲的势头发展，城市家庭饲养宠物也有增多趋势。目前，北京市个人养犬约60万只，犬类养殖场200余个，为犬类服务的医院、场所有300余家。另外，还有犬饲料加工厂、犬服装厂、犬玩具加工厂等，社会年产值在10亿元以上。一个新兴的产业正在蓬勃发展，宠物犬的饲养也对调节人们的生活也起到了积极作用[1]。与此同时，人们逐渐意识到，犬和人的共患病也在日趋威胁着人类的健康，如狂犬病、布鲁氏杆菌病、真菌病、寄生虫病等[2]。犬类能够携带多种人畜共患病的病原，其代谢物污染环境，危害人类和其它动物的健康。其中危害较大而又常见的是弓形体病。

       1弓形体病(Toxoplasmosic)及弓形虫(Toxoplasma gondii)

       1.1弓形虫及弓形虫的生活史

       弓形体病的病原为龚地弓形虫[3]，属于原生动物门孢子虫纲肉孢子虫科弓形虫属，是一种重要的机会致病原虫，肉孢子虫科弓形虫属，专性细胞内寄生。目前，认为只有一个种，一个血清型[4]。弓形虫的整个生活史是在终宿主和中间宿主内完成的（图1）。

       弓形虫生活史可分为肠内阶段和肠外阶段。肠内阶段出现于终末宿主体内，肠外阶段可出现于终末宿主和中间宿主体内。

       弓形虫的中间宿主种类很多，已报到的有200多种，包括肉食兽、食虫动物、啮齿动物、猪、草食兽、灵长类、人、其他哺乳动物和鸟类[5]。

       弓形虫的终末宿主为肉食科动物，已证明的有猫和其他一些野生猫科动物。

       弓形虫的裂殖体和有性生殖阶段虫体可出现于猫和其他猫科动物小肠绒毛上皮细胞中。

       裂殖体呈圆形，直径12-15 μm，内有4-20个裂殖子。游离的裂殖子大小为7-10 μm×2.5-3.5 μm，前端尖，后端钝圆。裂殖子经过数代裂殖生殖后变为配子体，一种为大配子体，另一种为小配子体。小配子体可形成许多小配子，大配子体只形成1个大配子。大小配子结合形成合子，合子形成卵囊。卵囊在猫和其他猫科动物小肠绒毛上皮细胞内产生。卵囊呈球形，孢子化后为亚球形，大小11-14 μm×9-11μm，无微孔、残体和极粒，含有2个椭圆形孢子囊，大小8.5 μm×6 μm，无斯氏体，但有孢子囊残体。子孢子大小为8 μm×2 μm。

       速殖子、包囊可出现于中间宿主的多种细胞中，包括神经元细胞、小胶质细胞、内皮细胞、肝实质细胞、肺和腺上皮细胞、心肌和骨骼肌细胞、胎膜和白细胞。速殖子（图2）呈弓形、月牙形或香蕉形，一端尖，一端钝，大小为4-7 μm×2-4 μm。经姬姆萨染液染色后，胞浆呈淡蓝色，有颗粒，核深蓝色。速殖子主要出现于急性病例。

       有时在宿主细胞内可见到许多速殖子簇集在一起，形成“假囊”，速殖子以内二分裂法增值。急性感染中，速殖子可游离于血和腹腔渗出液中。

       包囊（也称组织囊）见于慢性病例的多种组织，呈圆形，有较厚的囊膜，直径50-69 μm，可随虫体的繁殖而不断增大，达100 μm，可在感染动物体内长期存在。囊内虫体称慢殖子，数目由几十到几千。包囊形成是机体免疫力作用于虫体的结果，若免疫力消失，慢殖子从包囊中释放出来，可以侵入新的细胞，再度引起发病。

       中间宿主吞吃了孢子化卵囊、孢子囊、速殖子、包囊、慢殖子或经胎盘都可造成感染。子孢子可通过淋巴和血液循环进入有核细胞，进行内二分裂增殖，形成速殖子和假囊，并引起急性疾病。当宿主很快产生免疫力时，虫体繁殖受阻，存留的虫体在一些脏器组织中，特别是脑组织中形成包囊，长期存在[5]。

       猫等终末宿主吞噬了卵囊、孢子囊、速殖子、慢殖子等而感染，除了一部分虫体进入肠外阶段发育外，另一些进入肠上皮细胞进行肠内阶段发育。裂殖生殖的代数不详，但发现有5种类型。之后进入配子生殖阶段，再形成合子和卵囊。从感染到排除卵囊需3-5d时间，排卵囊高峰在5-8d之间。卵囊在外界环境中完成孢子化过程需1-5d。肠内和肠外阶段可在猫体内同时进行[5]。

       由此可以推断出弓形体病的发生和传播过程是：当宠物等动物食入了未经无害化处理并含有处于生活状态的弓形虫滋养体和孢子囊的动物肉、内脏、乳汁后，就可能感染弓形体病；然后，已感染或发病的宠物将其体内的弓形虫卵囊随粪便排出，在土壤中经1-5天逐渐孢子化，成熟后的孢子便能使人或其他动物感染和发病。

       1.2弓形体病的概念、临床表现及流行情况

       弓形体病也称弓形虫病、弓浆虫病，是一种以猫为终末宿主的世界性分布的人畜共患寄生虫病，主要侵害呼吸和神经系统。在临床表现上，犬弓形体病多数为无症状的隐性感染，幼年犬和青年犬感染较普遍而且较严重。只有在急性期，以发热、腹泻、肺炎、脑炎为特征，症状类似犬瘟热、犬传染性肝炎[6]。主要表现为发热、厌食、精神萎靡、虚弱、谵妄，并发生脑炎、心肌炎、肺炎、肝炎。经胎盘感染胎儿，可引起死产、早产或严重损伤[7]。

        据文献报道，我国猫、犬的弓形虫感染非常普遍，猫弓形虫的感染率在15.16～73.00%之间，犬弓形虫感染率为3.69～33.00%[8]。

       1.3国内外对犬弓形体病的研究概况

       由于从犬粪中检出弓形虫卵囊的机会甚微[9]，因此弓形虫流行病学调查多采用免疫学检查方法。免疫学检测的常用标本有血清、唾液等。

        广州医学院寄生虫学教研室采取了通过唾液作为标本的方法对弓形体病进行诊断。最初，采用常规间接ELISA法检测猫、犬唾液样本，结果所有样本均为阴性结果，推测可能是由于唾液中特异性IgG的含量较低和方法不够敏感的缘故。后来改用更敏感的双抗夹心ELISA，才解决了这个问题。说明针对唾液的特点选用敏感性更好的检查方法，方能取得较准确的结果[10]。

       由于通过唾液作为标本对弓形体病进行诊断所需要的条件较高，所以本实验采取通过血清作为标本进行免疫学检测的方法对犬弓形体病进行诊断。

       由于凝集反应方法简便、敏感度高等特点，本实验采取间接凝集反应的方法对犬弓形体病进行诊断。间接凝集反应又被称为被动凝集反应，是一种将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象。这种反应适用于各种抗体和可溶性抗原的检测，其敏感度高于沉淀反应[11]。

       间接血凝试验是以红细胞作为载体的间接凝集试验。间接血凝试验可在微量滴定板或试管中进行，将标本倍比稀释，同时设不含标本的稀释液对照孔。在含稀释标本1滴的板孔中，加入0.5％致敏红细胞悬液1滴，充分混匀，置室温1～2小时，即可观察结果。凡红细胞沉积于孔底，集中呈一圆点的为不凝集（一）。如红细胞凝集，则分布于孔底周围。根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱（图3），以＋＋凝集的孔为滴度终点。

       2.弓形体病高危人群及其危害

       人感染弓形体后通常呈隐性型，主要危害是先天性弓形体病。它是人类先天畸形、缺陷及先天性疾病的主要原因之一[12]。

       2.1孕妇及胎儿

       孕 妇感染弓形虫后多数无明显临床症状，但隐性感染同样可引起胎儿宫内感染，造成流产、早产、死产、先天畸形、眼底损害、智力低下或发育不全等。众多学者的研 究表明孕妇弓形虫感染率较高．胎儿感染率与母体初次感染的孕期有关，孕晚期感染胎儿受染率高于孕早期，但胎儿损伤程度与胎龄相反[13-14]。

       2.2职业人群

       流 行病学资料显示，弓形虫感染率有明显的职业分布特点。接触家畜，特别是接触生肉的职业明显高于其他职业人群。畜禽是弓形虫的重要传染源，病原学调查证实有 弓形虫寄生的哺乳动物有141种，其中猫的感染率最高，可反复感染排出卵囊，传染源意义重大。另外，猪、狗、羊的感染率也较高。赵玉强[15]等报道在饲养不同种类动物的人群中，以养猫同时养狗户的弓形虫感染率为高；从事猪肉制品加工者感染率最高，牛羊肉类加工者次之；弓形虫感染率可随接触时间的延长而增高。马彦等[16]调查肉联厂从业人员的弓形虫感染率为19.20%，弓形虫感染与接触生猪及其体液、内脏有关。因此，搞好职业卫生及防护．有利于减少职业性弓形虫感染。

       2.3免疫力低下者[13]

       关 于艾滋病合并感染弓形虫的报道不少，两种病之间的关系极为密切与复杂。新疆2000年的调查显示，HIV阳性的病人中合并弓形虫感染（IgG）高达 26%，与正常人群的2.5%相比差异有统计学意义，提示HIWAIDS感染弓形虫的机会极高。国际上80年代常有不少早期检测弓形虫抗体阳性，进一步 检查确定为艾滋病的病例报道。而艾滋病人最后死于合并症弓形虫病的病例亦不少。弓形虫感染本身可诱导免疫抑制，故两者有相互促进感染，促进机体损害的关 系。此外器官移植技术的开展使得免疫力低下者呈增长趋势，据C0nrath[17]报道，4例心脏移植手术病人术后3～6月间分别出现眼部损害，经证实为 弓形虫视网膜脉络膜炎，故建议对器官移植病人和输血员进行弓形虫的检测[13]。

       2.4其他疾病患者

       近 年来关于精神病与弓形虫的关系的报道越来越多。原因可能有：①弓形虫感染可能影响脑的功能．精神分裂症与脑部的一些功能有一定关系。②精神病患者存在某些 免疫缺陷，造成机会性感染。③精神病患者生活不能自理，卫生状况较差，感染弓形虫的机会和频率增高。一些不明原因的眼疾患者、肺结核患者、急性脑卒中以及 宫颈癌患者弓形虫感染率均明显高于对照组。弓形虫感染可影响机体的多个器官组织，近年发现，多种原因不明的疾病及疾病病情的加重与弓形虫感染有关[13]。

       3实验方法

       被实验采用间接血凝试验（IHA）的诊断方法，这种方法敏感性强，操作简便。

       3.1样品的采集及处理

       2005年10月至2006年1月，对北京市四城区和四个郊县内的102犬只进行了抽样调查，共采样102个。犬颈静脉采血3-5ml，弓形虫试验需要全血3-5ml备用。

       静 脉采血过程：将动物保定，使其头部微仰，采样人用拇指按压住颈静脉近心端处（如需要剪毛，取出事先准备好的剪毛剪，贴近皮肤表面，剪掉需要采样部位的被 毛），取酒精棉球消毒要采血的部位，取注射器靠近心端进针，看到回血，回抽注射器，采够需要的血量，松开回抽的注射器，以保证抽出注射器后没有空气与血液 的撞击，确保血液质量，采血结束后让保定人员取脱脂干棉球轻轻按压住针孔部位，不要揉针孔，防止血液流出体外或淤滞皮下。

       静置40分钟，3000转/分钟高速离心3分钟分离血清3.1.34。C冷藏保存血清。注意血清不要反复冻融，否则影响血清效价

       3.2.间接血凝试验（IHA试验）

       材料准备

       96（12×8）孔110。V形有机玻璃反应板，100μl微量加样器，振荡器，医用离心机，移液管，酒精灯等。

       弓形虫诊断试剂的准备

       从冰箱冷藏室中取出弓形虫检测相关试剂：弓形虫阳性血清，弓形虫阴性血清，稀释液，抗原诊断液等。

       抗原诊断液的配制：将冻干抗原诊断液，按瓶上标示毫升数加入灭菌蒸馏水，充分混匀后，2000转/分离心5分钟，弃去上清，再加入等量稀释液混匀后，静置24h备用。

       操作方法

       （1）标注

       根据检测样本数量，在96孔有机玻璃反应板上分别设定阳性对照组、阴性对照组、被检血清组，每组一排（8孔），并进行标注。

       （2）加稀释液

       用微量加样器往96孔有机玻璃反应板每孔加75μL稀释液。每个样品加8孔。阳性、阴性血清对照均加8孔。

       （3）阳性对照组加样

       在 阳性对照排第1孔加入25μl弓形虫阳性血清，逐次递减作倍比稀释，分别用移液枪在第1孔内反复吸入排出孔内加液，以便混匀稀释液和血清，然后把吸入的 第1孔的25μl液体排入第2孔，重复操作，直至第7孔，弃去剩余25μl。最后一孔为空白对照组（稀释液）。

       （4）阴性对照组加样

       在阴性对照排第1孔加入25μl弓形虫阴性血清，同上方法逐次递减作倍比稀释。最后一孔为空白对照组（稀释液）。

       （5）待检血清组加样

       在各样品排第1孔分别加入对应待检血清，同上方法逐次递减作倍比稀释。最后一孔为空白对照组（稀释液）（见表1-1）。

       （6）加入诊断液

       将准备好的诊断液摇匀，用微量加样器加25μL诊断液于每孔中。加完后将反应板置微量振荡器上振荡1-2min，直至诊断液中的血球分布均匀，从振荡器上取下反应板，用干净的玻璃板或纸板盖住反应板，以防灰尘落入，22-37℃静置2h-3h后观察结果。

       3.3结果判定

       在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定，否则应重做。

       间接血凝试验的判定标准如下：

       ++++：100%红细胞在孔壁下部成均质的膜样凝集。边缘整齐，致密。因重力关系，膜样凝集的红细胞有时出现下滑现象。

       +++：75%的红细胞在孔壁下部呈膜样凝集。不凝集的红细胞在孔底中央集中成很小的圆点。

       ++：50%的红细胞在孔壁更下部呈稀疏的凝集，不凝集的红细胞在孔底中央集中成较大的圆点。

       +：25%的红细胞在孔底凝集，其余不凝集的红细胞在孔底中央集中成大的圆点。

       -：所有的红包均不凝集，并集中于孔底中央呈规则的最大的圆点。

       被检血清第3孔（1：64稀释）达到“++”或以上，将被检样品判为阳性。

       被检血清第3孔（1：64稀释）为“+”或“-”，将被检样品判为阴性。

       4试验结果

       158个被检样品中，5个为阳性，2个为疑似。阳性检出率为3.16%，其中雄性犬阳性检出率为4.21%，雌性犬检出率为1.59%。

       5讨论

       本次实验结果显示，犬弓形虫感染阳性比率低于赵慰先主编的《人体寄生虫学》中犬弓形虫3.69～33.00%的感染率，其原因可能为以下几点：

       （1）北京市民对人畜共患病的防疫意识增强了，使得弓形虫的感染率有所下降。

       相比于1994年，人们饲养宠物的同时更加关注宠物以及人类的健康问题，在有些宠物医院，已经开展了弓形虫的实验室检查，方便了畜主及早发现和治疗其宠物的弓形体病，因而使得此病的患病机率大大降低。

       （2）采样以警犬、宠物犬占大多数，流浪犬及农村家养犬较少。

       本实验所采集的血液样本中，警犬、宠物犬占大多数，这类犬群体的饲喂条件较好，其饲养者对犬只的健康状况较为关注；而饲喂条件较差的流浪犬及农村家养犬，由于条件限制，采样相对较少。

       雌性犬患此病以流产症状多见，在警犬、宠物犬中较易引起饲养者的注意，而雄性犬则多以无症状的隐性型为主，较容易忽略，顾此次调查中雄性犬阳性检出率高于雌性犬。

       （3）本试验采样数量偏少，不能全面反映北京市该病的流行状况。

       （4）血清在制作保存过程中有一定的溶血，对结果的判定有一定影响。